Proizvodi

Fosforilacija proteina regulira različite stanične funkcije i igra ključnu ulogu u ranom razvoju biljaka.Kako bismo nadopunili i proširili prethodna istraživanja fosforilacije proteina u sadnicama Arabidopsis upotrijebili smo alternativni pristup koji kombinira ekstrakciju proteina u nedenaturirajućim uvjetima s obogaćivanjem afinitetnom kromatografijom imobiliziranih metalnih iona (IMAC) intaktnih fosfoproteina u ekstraktima osiromašenim Rubiscom, nakon čega slijedi identifikacija korištenjem dvodimenzionalne gel elektroforeze (2-DE) i tekućinske kromatografije-tandem masene spektrometrije (LC-MS/MS).Digestija tripsina u gelu i analiza odabranih mrlja gela identificirala je 144 fosforilirana peptida i ostataka, od kojih je samo 18 fosfopeptida i 8 fosfozita pronađeno u bazama podataka fosforilacijskih mjesta Arabidopsis thaliana PhosPhAt 4.0 i P3DB.Više od polovice od 82 identificirana fosfoproteina bilo je uključeno u metabolizam ugljikohidrata, fotosintezu/disanje ili mehanizme odgovora na oksidativni stres.Čini se da obogaćivanje intaktnih fosfoproteina prije 2-DE i LC-MS/MS poboljšava detekciju fosforiliranih ostataka treonina i tirozina u usporedbi s metodama koje koriste obogaćivanje na razini peptida, što sugerira da su dva pristupa donekle komplementarna u smislu pokrivenosti mjesta fosforilacije.Usporedbom rezultata za mlade sadnice s onima prethodno dobivenim za zrelo lišće Arabidopsis identificirano je pet proteina koji su različito fosforilirani u tim tkivima, pokazujući potencijal ove tehnike za istraživanje dinamike fosforilacije proteina tijekom razvoja biljke.