Proizvodi

Način na koji se učinci simultanih mutacija kombiniraju da bi se promijenila enzimska aktivnost nije lako predvidljiv jer ti učinci nisu uvijek aditivni na linearan način.Dakle, karakterizacija učinaka simultanih mutacija aminokiselinskih ostataka koji vežu supstrat može dati značajan doprinos razumijevanju supstratne specifičnosti enzima.U beta-glikozidazi iz Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), oba ostatka Q39 i E451 stupaju u interakciju sa supstratom i to je bitno za definiranje specifičnosti supstrata.Dvostruki mutanti Sfbetagly (A451E39, S451E39 i S451N39) pripremljeni su mutagenezom usmjerenom na mjesto, eksprimirani u bakterijama i pročišćeni korištenjem afinitetne kromatografije.Ovi enzimi karakterizirani su korištenjem p-nitrofenil beta-galaktozida i p-nitrofenil beta-fukozida kao supstrata.Omjer k cat/Km za jednostruke i dvostruke mutante Sfbetaglya koji sadrže mutacije usmjerene na mjesto na položajima Q39 i E451 upotrijebljen je da se pokaže da učinak dvostrukih mutacija (Gdouble) na slobodnu energiju ESdouble dagger (kompleksa enzim-prijelazno stanje) daggerxy) nije zbroj učinaka koji proizlaze iz pojedinačnih mutacija (Gdouble daggerx i Gdouble daggery).Ova razlika u Gdouble daggeru ukazuje na to da se učinci pojedinačnih mutacija djelomično preklapaju.Stoga se ovaj uobičajeni učinak računa samo jednom u Gdouble daggerxy.Kristalografski podaci o beta-glikozidazama otkrivaju prisutnost bidentatne vodikove veze koja uključuje ostatke Q39 i E451 i istu hidroksilnu skupinu supstrata.Stoga i termodinamički i kristalografski podaci sugeriraju da ostaci Q39 i E451 međusobno utječu na međusobne interakcije sa supstratom.