Proizvodi

Kako bismo specifično kvantificirali nekoliko metabolita 5-fluorouracila (5-FU) i dva endogena monofosfatna nukleotida, razvili smo originalnu metodu temeljenu na tekućinskoj kromatografiji – tandem masenoj spektrometriji (LC-MS/MS).Ovaj je test omogućio određivanje: (i) unutarstanične proizvodnje 5-fluoro-2'-deoksiuridin-5'-monofosfata (5-FdUMP) iz 5-FU ili 5-fluoro-2'-deoksiuridina (5-FdUrd) , (ii) utjecaj koncentracije 5-FdUMP-a na unutarstanični omjer 2'-deoksiuridin-5'-monofosfat (dUMP)/timidin-5'-monofosfat (TMP), i (iii) opseg izlučivanja 5-FdUMP-a i 5-FU iz ljudskih stanica uzgojenih ABC transporterima.Pod našim eksperimentalnim uvjetima, stanice su inkubirane s 5-FU ili 5-FUrd.Zatim su stanični proteini istaloženi metanolom.Ovaj postupak je omogućio visok oporavak ekstrakcije.Osim toga, za mjerenje izlučivanja 5-FU i 5-FdUMP iz stanica, proveli smo kvantifikaciju ovih molekula u mediju kulture.Mediji su ili izravno ubrizgani (5-FU) ili su podvrgnuti ekstrakciji čvrste faze korištenjem Oasis Wax ekstrakcijskog uloška (5-FdUMP).Razdvajanje analita provedeno je na stupcu dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) s izokratskim načinom rada koristeći amonijev format pufer/metanol/voda (5/5/90, v/v) kao mobilnu fazu.Vrijeme rada nije prelazilo 6,2 min.Analiti su ionizirani u sučelju elektrospreja u načinu rada s negativnim ionima.Validirali smo metodu u rasponu od 2,5-150 ng mL -1 prema spojevima.Varijabilnost unutar i između ispitivanja bila je manja od 10% tijekom sedam dana.Svi spojevi bili su stabilni u stanicama ili u mediju kulture kada su uzorci pohranjeni na -20 °C najmanje dva tjedna i nakon tri ciklusa smrzavanja-odmrzavanja.U oba medija nije primijećen učinak matrice.