vijesti

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog supstrata β-galaktozidaze, koji je visoko inducibilan.Pod indukcijom IPTG, induktor može formirati kompleks s represorskim proteinom, tako da se konformacija represorskog proteina mijenja, tako da se ne može kombinirati s ciljnim genom, a ciljni gen se učinkovito eksprimira.Dakle, kako treba odrediti koncentraciju IPTG tijekom eksperimenta?Je li što veće to bolje?
Prvo, shvatimo princip indukcije IPTG: laktozni operon (element) E. coli sadrži tri strukturna gena, Z, Y i A, koji kodiraju β-galaktozidazu, permeazu, odnosno acetiltransferazu.lacZ hidrolizira laktozu u glukozu i galaktozu, ili u alo-laktozu;lacY omogućuje laktozi iz okoline da prođe kroz staničnu membranu i uđe u stanicu;lacA prenosi acetilnu skupinu s acetil-CoA na β-galaktozid, što uključuje uklanjanje toksičnog učinka.Osim toga, postoji radna sekvenca O, početna sekvenca P i regulatorni gen I. Kod gena I je represorski protein koji se može vezati na položaj O operatorske sekvence, tako da je operon (meta) potisnut i ugašen.Postoji također mjesto vezivanja za vezno mjesto kataboličkog gena aktivatora proteina-CAP uzvodno od početne sekvence P. Sekvenca P, O sekvenca i mjesto vezanja CAP zajedno čine regulatornu regiju lac operona.Geni koji kodiraju tri enzima regulirani su istim regulatornim područjem kako bi se postigla koordinirana ekspresija genskih proizvoda.

U nedostatku laktoze, lac operon (meta) je u stanju potiskivanja.U to vrijeme, lac represor eksprimiran I sekvencom pod kontrolom PI promotorske sekvence veže se na O sekvencu, što sprječava vezanje RNA polimeraze na P sekvencu i inhibira inicijaciju transkripcije;kada je prisutna laktoza, može se inducirati lac operon (meta). U ovom operonskom (meta) sustavu pravi induktor nije sama laktoza.Laktoza ulazi u stanicu i katalizirana je β-galaktozidazom da bi se pretvorila u alolaktozu.Potonji se, kao induktorska molekula, veže na represorski protein i mijenja konformaciju proteina, što dovodi do odvajanja represorskog proteina od O sekvence i transkripcije.Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima isti učinak kao alolaktoza.To je vrlo snažan induktor, koji se ne metabolizira od strane bakterija i vrlo je stabilan, pa se široko koristi u laboratorijima.

Kako odrediti optimalnu koncentraciju IPTG?Uzmimo E. coli kao primjer.
Genetski modificirani soj E. coli BL21 koji sadrži pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT) inokuliran je u tekući LB medij koji sadrži 50 μg·mL-1 Amp i uzgajan preko noći na 37°C.Gornja kultura inokulirana je u 10 boca sa 50 mL svježeg LB tekućeg medija koji sadrži 50 μg·mL-1 Amp u omjeru 1:100 za ekspanzionu kulturu, a kada je vrijednost OD600 bila 0,6~0,8, IPTG je dodan konačnoj koncentraciji.To je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Nakon indukcije na istoj temperaturi i u isto vrijeme, iz nje je uzet 1 mL bakterijske otopine, a bakterijske stanice su sakupljene centrifugiranjem i podvrgnute SDS-PAGE kako bi se analizirao utjecaj različitih koncentracija IPTG na ekspresiju proteina, a zatim odaberite koncentraciju IPTG s najvećom ekspresijom proteina.
Nakon pokusa, ustanovit će se da koncentracija IPTG nije što veća.To je zato što IPTG ima određenu toksičnost za bakterije.Prekoračenje koncentracije također će ubiti stanicu;i općenito govoreći, nadamo se da što je više topivog proteina izraženo u stanici, to bolje, ali u mnogim slučajevima kada je koncentracija IPTG previsoka, stvorit će se velika količina inkluzija.Tijelo, ali se smanjila količina topivih proteina.Stoga najprikladnija koncentracija IPTG često nije što veća to bolja, nego što je niža koncentracija.
Svrha indukcije i uzgoja genetski modificiranih sojeva je povećanje prinosa ciljnog proteina i smanjenje troškova.Na ekspresiju ciljnog gena ne utječu samo faktori samog soja i ekspresijski plazmid, već i drugi vanjski uvjeti, kao što su koncentracija induktora, temperatura indukcije i vrijeme indukcije.Stoga, općenito, prije ekspresije i pročišćavanja nepoznatog proteina, najbolje je proučiti vrijeme indukcije, temperaturu i koncentraciju IPTG kako bi se odabrali odgovarajući uvjeti i dobili najbolji eksperimentalni rezultati.